南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院孟慶國課題組研究了MIRA 和 MIRA-LFD 螺原體檢測方法的開發(fā)和應(yīng)用。相關(guān)研究成果以“Development and application of the MIRA and MIRA-LFD detection methods of Spiroplasma eriocheiris”為題在國際學(xué)術(shù)期刊journal of invertebrate pathology在線發(fā)表，期刊影響因子為3.4。
研究背景：
中華絨螯蟹養(yǎng)殖已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導(dǎo)和支柱。由螺原體引起的顫抖?。?/span>TD）是中華絨螯蟹最具破壞性的疾病。因此，建立一種快速簡便的檢測方法，對疾病的預(yù)防、控制和及時治療具有重要意義。本研究構(gòu)建了一種能在室溫下快速簡便檢測螺原體的核酸擴(kuò)增方法-多酶恒溫快速擴(kuò)增法（MIRA）和能以視覺的形式迅速讀出的方式MIRA檢測結(jié)果的MIRA-LFD。
研究結(jié)果：
本研究根據(jù)螺原體的保守基因序列，構(gòu)建并篩選了合適的擴(kuò)增引物。設(shè)計并標(biāo)記了相關(guān)的特異性探針和所選的特異性擴(kuò)增引物。然后對 MIRA 和 MIRA-LFD 反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，MIRA 和 MIRA-FFD 分別能在 37℃的溫度下用 30 分鐘和 10 分鐘鑒定出螺原體。
為了研究 MIRA 和 MIRA-LFD 的特異性，選擇了三種革蘭氏陰性菌（枯草桿菌、蘇云金芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌）、三種革蘭氏陽性菌（大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌）和螺原體。結(jié)果表明，MIRA 和 MIRA-LFD 對 螺原體具有高度特異性，對其他六種病原體沒有反應(yīng)。
然后對比了 PCR、MIRA 和 MIRA-LFD 三種檢測方法的靈敏度。結(jié)果表明，PCR 的檢測限為 1 ng/L，而 MIRA 和 MIRA-LFD 的檢測限為 10 pg/L
最后使用優(yōu)化過的MIRA和MIRA-LFD 反應(yīng)體系、反應(yīng)引物、反應(yīng)條件，針對隨機(jī)提取的17個樣本DNA以及陽性對照與陰性對照分別進(jìn)行了中華絨螯蟹螺原體MIRA，MIRA-LFD和PCR檢測. 通過分析比對不同檢測方法的結(jié)果，判斷本實驗所建立的中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測方法可行。
總之，本研究構(gòu)建的MIRA 和 MIRA-LFD 可用于快速檢測中華絨螯蟹螺原體，具有快速、靈敏和特異性強(qiáng)的優(yōu)點，不需要任何專業(yè)設(shè)備即可檢測到螺原體。這些檢測方法對于中華絨螯蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖中的顫抖病控制至關(guān)重要。在這種情況下，可以及時采取早期檢測措施，避免病原體的傳播，減少中華絨螯蟹顫抖病造成的損失，從而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
文中涉及使用的檢測試紙條以及MIRA核酸擴(kuò)增試劑盒如下表所示，沃博生物現(xiàn)貨提供：
貨號
產(chǎn)品
規(guī)格
JY0209
雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
50T
JY0201
單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
50T
JY0307
Tiosbio? CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測試紙條
50T
JY0301
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條
50T
JY0308
Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍）
50T
WLB8201KIT
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）
48T
WLE8202KIT
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）
48T
WLN8203KIT
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）
48T
WLRB8204KIT
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）
48T
WLRE8205KIT
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）
48T
WLRN8206KIT
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）
48T
WLB5001
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型）
100T
WLN5002
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型）
100T
WLR5003
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型）
100T
WLRB5001
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型）
100T
WLRN5002
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型）
100T
WLRE5003
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型）
100T