乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，可導致急性或慢性肝病，嚴重時可能會引發(fā)肝硬化、肝衰竭甚至肝癌 。HBV通過血液、母嬰傳播和性接觸進行傳播，全球已有超過2億人感染，其中部分人發(fā)展為慢性乙型肝炎。作為病毒復制和傳染性的直接標志，HBV DNA檢測在評估病毒傳染性和抗病毒療效方面至關重要 。盡管實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）已廣泛用于HBV DNA的檢測，但該方法也存在一些缺陷 ，例如檢測周期較長、需要大型設備等。因此，HBV DNA檢測在提高檢測靈敏度和檢測速度等方面仍需進一步改進。
本研究旨在基于RAA-CRISPR/Cas13a系統(tǒng)建立一種快速、靈敏且特異性良好的HBV DNA檢測方法，為臨床監(jiān)測HBV的感染以及評估治療效果提供了新的思路。
實驗方法：
1.試劑與儀器：HBV DNA陽性質粒（博邁德生物科技有限公司）；HBV國際標準品（英國國家生物標準與控制研究所）；瓊脂糖（索萊寶科技有限公司）；Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液和GoldenViewTM（博邁德生物科技有限公司）；TIANamp病毒DNA/RNA提取試劑盒（天根生物技術有限公司）；RAA核酸擴增試劑盒和逆轉錄-重組酶介導的等溫擴增試劑盒（眾測生物科技有限公司）；乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（圣湘生物）；凝膠成像儀和 PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）；Roche Light Cycler 480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀器（瑞士羅氏公司）。
2. HBV DNA 質粒的構建：從HBV數(shù)據(jù)庫（ https：//hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/HBVdbIndex）中下載了全長HBV DNA序列。使用Jalview軟件比較了HBV-P區(qū)序列。比較后，選擇具有95%以上保守性的HBV DNA序列，然后以含有部分 HBV 基因組的質粒（GenBank ID：LC456126.1 位點：625~758）和 pUC57 為模板構建HBV DNA陽性質粒，并根據(jù)保守序列設計crRNA和RAA引物。HBV保守序列篩查結果：5′-TTTCGCAAAATT CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGG-3′（134 bp）。
3. CRISPR-Cas13a體系檢測HBV DNA的原理及構建：從臨床樣本的血漿中提取總HBV DNA，使用篩選出來的RAA引物對靶向的HBV DNA區(qū)域進行RAA擴增，然后通過T7轉錄將其轉化為單鏈RNA（single strand RNA，ssRNA）。在Cas13a檢測系統(tǒng)中，目的ssRNA片段可以被Cas13-crRNA復合物特異性識別和結合，以觸發(fā)Cas13a活性并切割熒光報告探針釋放熒光信號，這些熒光信號可以通過熒光儀器進行檢測并獲得熒光信號的強弱，從而反映出樣本中HBV DNA的存在。整個檢測流程大約需要1 h。
4. RAA引物和crRNA設計：從已獲得的HBV保守序列中設計3 對特異性的RAA 擴增引物和3 條 crRNA 序列（ 表1 、 2 ）。所有序列由上海生工生物技術有限公司合成。
5.血漿HBV DNA的提?。菏褂肨IANamp病毒DNA/RNA試劑盒從HBV陽性患者血漿樣本中提取20 μl HBV DNA，提取的HBV DNA存放在-80 ℃冰箱備用。
6. DNA瓊脂糖電泳：將1 g瓊脂糖與100 ml 1×Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液混合，加熱溶解后冷卻至50~60 ℃，然后加入10 μl GoldenView TM核酸染料。將RAA擴增產物上樣凝膠孔后，在170 V電泳約20 min，取出凝膠塊并放入凝膠成像儀中進行檢查和圖像保存。
7. RAA引物和crRNA的篩選：使用3對引物分別對10 3拷貝/μl的陽性質粒進行RAA擴增，通過觀察CRISPR-Cas13a檢測的熒光信號值篩選擴增效率最高的RAA引物。10 3拷貝/μl的陽性質粒分別使用crRNA1、crRNA2和crRNA3進行CRISPR-Cas13a檢測，觀察反應結束時（60 min）的熒光強度，篩選檢測效率最高的crRNA做后續(xù)實驗。
8. RAA 擴增：RAA核酸擴增試劑盒反應總體積為50 μl，其中上游引物（10 mmol/L）、下游引物（10 mmol/L）和 MgCl 2各2 μl，DNA 模板5 μl。反應條件為 37 ℃ 30 min，陰性對照為無酶無菌水。
9. CRISPR-Cas13a檢測：CRISPR-Cas13a檢測體系包括：NTP混合物（2.5 mmol/L）2 μl，LwCas13a蛋白（25 nmol/L）1 μl，RNA酶抑制劑1 μl，T7 RNA聚合酶0.5 μl，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液（20 mmol/L）0.5 μl，MgCl 2溶液（10 mmol/L）0.25 μl，crRNA（2 μmol/L）1.5 μl，熒光報告RNA（2 nmol/L）2.5 μl，無酶無菌水（ddH 2O）10.75 μl，擴增產物5 μl，總體積25 μl。其中crRNA序列為：GGGGAU UUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUACGAACCACUGAACAAAUGGCACUAGU，反應條件為 37 ℃ 1 h，陰性對照為無酶無菌水。
10.靈敏度評價：使用梯度稀釋HBV國際標準品（初始濃度為1×10 6 IU/ml，稀釋為1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0和1×10 -1 IU/ml）和HBV陽性臨床樣本（1×10 6、1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0 IU/ml和未檢測到HBV DNA）作為檢測模板，利用已建立的CRISPR-Cas13a檢測方法在不同的時間點進行3次以上的重復實驗，每次運行2個重復（復孔）。
11.特異性評價：為評價CRISPR-Cas13a系統(tǒng)檢測HBV DNA的特異性，本研究收集了其他常見的傳染性疾病的陽性臨床樣本各6例（HDV、HEV和HIV），提取總RNA后，通過逆轉錄-重組酶介導的等溫擴增技術后的擴增產物作為檢測模板進行交叉反應。該試驗在不同的時間點重復3次，每次運行2個重復。
12. qPCR檢測：使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒對不同病毒載量的HBV DNA陽性患者樣本進行qPCR檢測。反應條件：95 ℃ 5 min熱變性；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃自動延伸10 min。根據(jù)Ct值判斷結果：Ct值≤35為陽性，35<Ct值<40需重新檢測確認，Ct值無結果或>40為陰性。
13.統(tǒng)計學分析：應用GraphPad prism 8.0版本進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量采用表示，多組間的比較采用方差分析和Tukey多重比較檢驗，2組間的比較采用配對 t檢驗。雙側檢驗， P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
實驗結果：
一、RAA引物和crRNA篩選瓊脂糖凝膠電泳驗證了9組RAA引物（F1、F2、F3和R1、R2、R3排列組合）的可用性和擴增效率。根據(jù)亮度結果（ 圖1 ），HBV-RAA-F2、HBV-RAA-R2配對的RAA引物對表現(xiàn)出最佳的擴增效率（17 602.2±1 437.2），與陰性對照（5 791.64±472.8）差異有統(tǒng)計學意義（ t=11.04， P<0.01）。crRNA1、crRNA2和crRNA3的熒光強度分別為200.7±9.9、181.1±8.8和229.0±4.3，其中crRNA3的熒光值均高于crRNA1（ t=4.536， P<0.01）和crRNA2（ t=8.479， P<0.01），使用crRNA3用于后續(xù)檢測（ 圖2 ）。
二、靈敏度和特異性的評價使用CRISPR-Cas13a檢測60 min時，1×10 0 IU/ml的HBV DNA熒光強度（23.7±11.5）與陰性對照（1.8±0.3）差異有統(tǒng)計學意義（ t=47.96， P<0.01）（ 圖3A ）。反應進行 60 min 時，HBV陽性患者樣本的檢測相對熒光值與陰性對照的熒光值分別為196.3±7.6和4.8±1.1，差異有統(tǒng)計學意義（ t=13.63， P<0.01）。HIV、HEV、HDV陽性患者樣本的檢測熒光值分別為5.4±1.5、4.9±1.6和5.0±1.0，與陰性對照的熒光值差異均無統(tǒng)計學意義（均 P>0.05， 圖3B ）。因此，該法檢測HBV DNA標準品的靈敏度可達到1×10 0 IU/ml。
實驗討論：
本研究將RAA與CRISPR檢測相結合建立了RAA-CRISPR 的精準檢測HBV DNA的方法，建立的檢測方法對HBV DNA陽性標準品的檢測靈敏度為1 IU/ml；對 HBV DNA 陽性樣本的檢測靈敏度也達到<10 IU/ml。本研究還對70 個HBV DNA陽性臨床標本進行檢測，結果顯示，CRISPR-Cas13a 檢測 HBV DNA的陽性率為 100%（70/70）。與qPCR檢測系統(tǒng)比較，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)能更快地檢測出HBV DNA陽性患者。本研究建立的檢測方法可以快速精準地檢測HBV DNA，但也存在一些不足之處。由于 CRISPR系統(tǒng)的“附帶切割”具有非特異性，即切割持續(xù)且隨機，因此對HBV DNA只能進行定性檢測，無法定量分析。本研究將RAA快速擴增與CRISPR-Cas13a相結合檢測HBV DNA，靈敏度高、特異性好。該方法還有望替代目前基于qPCR的 HBV DNA診斷方法，降低HBV檢測成本且有助于臨床HBV患者的早期干預，推動乙型肝炎的診斷和管理，為未來HBV的POCT檢測提供方向。